membuat preparat organ:)

Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen yang menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8 mikron. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron. Langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan penutupan. Larutan fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju fiksasi dalam sel (Botanika 2008).
Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui langkah-langkah dan cara pembuatan preparat jaringan hewan dengan metode paraffin dan mampu mengamati struktur jaringan hewan tersebut.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah mikroskop, gelas ukur, preparat, gleas objek, tabung reaksi, mikrotom, pipet tetes, pinset, oven, silet, tabung reaksi, dan botol fiksatif.
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah organ hewan, paraffin, larutan FAA, larutan Bouine, NaCl fisiologis, alkohol 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, larutan xilol, larutan hematoxilin, eosin, dan entellan.
Pembahasan
Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Pengamatan secara mikrokopis dari sesuatu jaringan yang normal sifatnya maupun yang mengidap sesuatu penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya bila dilakukan dari preparat jaringan yang telah dipersiapkan secara baik, telah dilakukan penyayatan yang cukup tipis, serta diberi pewarnaan yang sesuai, sehingga berbagai elemen jaringan yang diteliti lebih mudah untuk diamati. Dengan demikian, tidak saja penelitian secara mikroanatomi yang dapat dilakukan, tetapi juga memberi kemudahan dalam membedakan berbagai perubahan yang terjadi pada sel-sel jaringan yang diteliti. Adakalanya beberapa jenis jaringan memerlukan perlakuakan yang khusus untuk dapat menelitinya, seperti dalam hal jenis pewaranaan yang harus digunakan untuk sesuatu jenis jaringan tertentu (Sugiharto, 1989).
Suatu larutan fikasasi (fiksatif) yang baik akan mematikan serta mengawetkan semua isi sel dalam ukuran serta posisi semula dalam sel. Akan tetapi bila ditangani secara kasar, bahan akan rusak sebelum dimasukkan ke dalam larutan pengawet (Sugiharto, 1989).
Dilakukan fiksasi dengan menggunakan larutan FAA (Formalin, Asam asetat glasial, dan alkohol 70%), tujuan dari fiksasi adalah menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hamper sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup. Penggunaan FAA tersebut karena penetrasi alkohol dan asam asetat ke dalam jaringan dapat berlangsung dengan cepat sehingga pematian dan fiksasi dapat berjalan dengan cepat, juga merupakan larutan yang stabil dan pengawet yang baik.
Kemudian langkah selanjutnya yaitu dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi mulai dari 40%, 60%, 80%, 95%, dan 100%, fungsi dari dehidrasi adalah untuk menghilangkan kandungan air dari jaringan Ricinus comunis tersebut sehingga dapat dikenakan larutan yang dapat bercampur atau larut dalam paraffin dimana bahan akan ditanam. Digunakan alkohol bertingkat tersebut agar jaringan kandungan airnya dapat keluar sedikit demi sedikit hingga pada konsentrasi 100% pengeluaran airnya pun maksimal.
Kemudian langkah berikutnya adalah dealkoholosasi yang menggunkan xylol : alkohol 100% secara bertingkat pula yaitu dengan perbandingan 1:3, 1:1, dan 3:1, hal ini dilakukan agar pengeluaran alkoholnya juga maksimal sehingga larutan xylol inilah yang nantinya dapat terikat langsung dengan paraffin dan agar jaringan tersebut dapat beradaptasi, dan dengan menggunakan xylol I dan xylol II langkah ini dilakukan agar jaringan betul-betul beas dari alkohol dan hanya ada xylol, , serta menggunakan xylol : paraffin yaitu 1 : 9 hal ini dilakukan untuk menghilangkan xylol dari jaringan.
Kemudian langkah selanjutnya adalah infiltrasi/penjernihan, yaitu campuran paraffin dan xylol diganti dengan paraffin murni yang bertujuan untuk menghilangkn kandungan xylolnya secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan.
Langkah selanjutnya yaitu penyelubungan dengan merendam jaringan dalam paraffin murni selama 15 menit diudara terbuka dan 15 menit di dalam oven, kemudian setelah mencair jaringan dimasukkan ke dalam blok dan dituangkan kembali paraffin murni kemudian dibiarkan pada suhu kamar agar parafinnya membeku selama 1 – 2 hari atau 48 jam. Hal ini bertujuan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak jaringan akar tersebut.
Kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan mikrotom
Metode parafin merupakan metode membuat sediaan sayatan dari organ hewan. Larutan NaCl fisiologis bersifat indeferen atau tidak bereaksi dengan jaringan sampel, sebagai isotonis untuk mempertahankan kondisi awal anatomi dari jaringan agar tidak berubah ketika proses.
Larutan Bouine terdiri dari, formalin 15 ml, Asam pikrat jenuh 5 m, asam asetat glasial 1 ml. Fungsinya untuk memfiksasi jaringan. Larutan Bouine dibuat dengan cara melarutkan asam pikrat dalam air panas dan dibuat jenuh, biarkan satu malam. Kemudian ditambahkan formaldehid 14% dan asam asetat glasialmasing-masing dengan perbandingan 75:20:5 (Manson et.al. 1982). fungsinya untuk melihat jaringan hewan menjadi lebih baik.(Manson J M, H Zenick,and R D Coslow. 1982. Teratology Test Methods for Laboratory Animals. New York: Ravent Press. // Jurnal sains dan teknologi farmasi, vol. 12, No. 1, 2007, halaman 32 -40, ISSN: 1410-0177. pengaruh pemberian vitamin C terhadap fetus pada mencit diabetes. Helmi arifin, Vivi delvita, Almahdy A.)
Tujuan fiksasi: menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan jaringan, mengawetkan komponen2 sitologis dan histologis, mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan untuk materi2 yang lembek akan terjadi koagulasi protoplasma dan maupun elemen2 di dalam protoplasma, jaringan dapat diwarna sehinggabagian2 dari jaringan dapat mudah dikenali. Reaksi fiksatif harus dapat menstabilkan protein dan menghubungkan (cross-link) protein2 sehingga dapat mempertahankan keadaan di dalam sel/jaringan seperti kondisi in vivo.
Alkohol untuk menarik air/menghilangkan air dari sel (dehidrasi) pada jaringan hewan yang digunakan. Bahan dehidrasi harus dapat menggantikan air yang ada di dalam sel/ jaringan dan mampu melanjutkan kemampuan fiksatif yang bersifat mengeraskan jaringan, sekaligus mampu larut di dalam clearing agent. Dehidrasi dilakukan secara bertahap/ bertingkat (70,80,95,100%).
Xilol berfungsi untuk menjernihkan (clearing) jaringan dari alkohol (dealkoholisasi), zat antara yang dapat larut dalam alkohol sekaligus dalam parafin. Syarat: dapat menggantikan etanol dengan cepat, dapat melarutkan media infiltrasi dengan mudah, tidak mengganggu terhadap jaringan. Dilakukan bertahap, alkohol:xilol (1:1), dilanjutkan ke xilol. Penjernihan akan membuat jaringan tampak menjadi tembus pandang/transparan. Xilol bersifat mengeraskan jaringan dan dapat menyebabkan jaringan mudah rapuhbila terlalu lama di xilol.
Larutan parafin digunakan dalam infiltrasi, berfungsi sebagai medium untuk menanam/embedding yang dimasukkan ke dalam jaringan secara bertahap, zat yang menempati ruang-ruang di dalam jaringan sehingga penyayatan jaringan tidak merubah strukturnya. Jenis parafin: parafin lunak dengan titik leleh sekitar 48ᵒC, parafin medium dengan titik leleh sekitar 52ᵒC, parafin keras dengan titik leleh sekitar 56ᵒC.
Embedding menggunakan parafin (parafin wax) atau lilin merupakan media tanam campuran hidrokarbon minyak bumi yang memiliki titk leleh berkisar antara 40-70ᵒC. Parafin untuk histologi biasanya bukan parafin murni tetapi sudah dicampur. Karena: mempertinggi kekerasan sehingga dapat membuat sayatan tipis pada suhu ambient tinggi, mempertinggi kerekatan media sehingga didapatkan suatu pita hasil sayatan, mengubah struktur kristal pada parafin.
Penyayatan blok parafin berisi jaringan terlebih dahulu dibentuk (trimming). Penyayatan dilakukan menggunakan alat yang disebut mikrotom. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek yang telah diberikan perekat albumen meyer (albumen/putih telur : gliserin ; 9:1) dan ditetesi air akuades. Selanjtnya ditaruh pada meja penangas, air yang hangat akan mengembangkan pita sayatan, sehingga ukuran sayatan mendekati ukuran sebenarnya.
Pewarnaan dilakukan setelah parafin pada sayatan dilarutkan dengan xilol karena tidak dapat mengikat air, sedangkan pewarnaan mengikat air. Setelah itu, sayatan direhidrasi dengan alkohol bertahap (100,95,80,70%) untuk mengkondisikan jaringan bisa dimasuki air. Dimasukkan dalam pewarna hematoksilin bertujuan untuk mewarnai inti sel (biru keunguan), sedangkan eosin untuk mewarnai sitoplasma menjadi merah muda.
Perlakuan dehidrasi kembali untuk mengeluarkan air dari dalam sel dengan alkohol bertahap (30,50,70,80,95,100%), direndam lagi pada xilol untuk memperkuat pengeluaran air dalam sel. Setelah itu, Mounting/penutupan sayatan oleh entellan yang tidak dapat larut dalam air.